高场核磁上机操作步骤(手动上样)

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1.1 实验安全须知

在进核磁实验室之前,首先和学生强调核磁实验室安全须知以及实验室规章。强调核磁实验室具有强磁场危险,如果有植入心脏起搏器或者人工金属关节的学生,禁止进入核磁实验室;不要带任何铁磁性的物质靠近磁体;关于地上黄黑斑马警戒线是5高斯线,如果没有必要,所有人员都尽量不要进入该区域。

接着老师对着仪器讲解核磁共振谱仪的构造。主要介绍磁体,磁体内部的低温液体包括用于超导的液氦和保温气体液氮;探头介绍,向学生说明核磁探头是从磁体底部安装上去的,而样品是通过压缩气体从上面被拖着降落到探头上的。当然顺着探头可以讲讲前置放大器,然后磁体机柜,最后就是装有核磁采集软件的电脑。

1.2 液体核磁样品配置
  • 样品要求:可溶解,没有铁磁性物质

  • 配置样品前需要准备:5mm 核磁管,氘代试剂

  • 配置要求:选择在EP管或者玻璃杯中进行配置,充分混合均匀,总样品体积 550ul~600ul(4cm 核磁管高度),溶液均匀稳定(澄清,均一),保持核磁管外壁干净无刮痕。

如果样品是具有顺磁性,依然可以测试核磁,但是有可能信号会很弱,甚至有可能没有办法锁场。如果样品是高盐浓度样品,同样可能会导致锁场和匀场失败,并且核磁谱峰会变弱和分辨率不行。

1.3 量规的使用

在配置好核磁样品以后,拿着核磁管到核磁室,你会使用转子和量规。以下是正确使用量规的方式。请先把转子放置到量规上,尽量少触摸转子的下端部分,然后把核磁管慢慢的从转子上面插进去,插到量规底部即可。

这个时候核磁管是套在转子上,请注意核磁管和转子的松紧程度,如果太松了,请更换转子。然后正确的拿核磁管方式如下所示,任何时候都是拧着自己的核磁管,请尽量少触碰转子。

1.4 手动进样上机操作

目前厦门大学化学化工学院共有9台高场核磁谱仪,其中8台是 Bruker 的仪器,另外1台是中科牛津的谱仪。有7台谱仪是完全开发给学生自主上机操作的液体核磁谱仪,其中3台 400MHz,2台 500MHz,1台 600MHz,1台 850MHz,而其中1台 400MHz 中科牛津配有自动进样器,1台 500MHz 和1台 600MHz 也都配备了 Bruker 的24孔的自动进样器,850MHz 配备的是单孔的自动进样器。这些 Bruker 仪器目前都是使用 TopSpin 3.x 版本,所以下面我们上机操作主要以这个版本采集软件讲解。

首先刚开始也是来先了解一下 TopSpin 3 的软件界面,如下图所示:(请注意,这个界面和处理界面的区别主要是在于这里面会有很多仪器状态指示,比如样品腔温度,采集信息等等)

  1. 确定前面实验已经做完,也就是“仪器运行状态”没有信息,检测磁体内部是否有样品,“样品腔”这样子(插不进去图片)代表里面有样品。如果别人的实验还没有做完,请和他人协商一下。如果可以停止,请用 halt 命令停止实验。

  2. ej ,开气体,因为核磁管是通过压缩气体慢慢送进磁体的,首先要开气体,如果里面有样品会把里面的核磁管弹出来,如果没有可以听到比较大的气流声,这个时候才能够把套在转子上的核磁管放到磁体上方,如下图所示。刚开始核磁管会悬浮在磁体上方,然后通过命令行 ij 关闭气体,核磁管缓慢降落在探头上方,等待样品确定已经降落到探头上方,样品腔状态显示为以后才能够进行下面的操作。


  3. edc/new,新建实验文件夹。如果你之前在该电脑已经有属于你的文件夹实验,我们建议你先把之前的文件夹实验打开成为当前实验,关于如何打开核磁数据,我会专门写一个文档。接着你可以通过 TopSpin 窗口左上方的白色方块或者使用命令行 edc/new


  4. lock,锁场。请确认样品已经到位。锁场是仪器自动寻找氘代试剂的信号峰,固定该溶剂峰的位置,减少因为系统导致的化学位移偏移,对于长时间多次累加平均不会引起化学位移偏移而降低分辨率。


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        可以通过上面的“Acquire”- >“lock”,也可以直接在命令行输入 lock ,会弹出氘代试剂窗口如下,选择你使用的氘代试剂,然后点击“OK”,等待它锁场完成。

        如果锁场失败,请依照底下步骤进行检测:

    • 如果没有使用氘代试剂,那就不需要做锁场,同样可以做实验;但是需要注意化学位移定标问题。

    • 对于一个样品,锁场只需要进行一次就可以了。同一个样品已经锁完场,做多个实验不需要在锁场;

    1. 是否加入氘代试剂

    2. 是否选择正确氘代试剂锁场

    3. 核磁管配置的样品溶剂高度是否过低

    4. 核磁管插入量规是否插入到底部

    5. 样品溶液是否均匀澄清,是否有顺磁性物质

    6. 输入 rsh 重新读取之前匀场参数,再次锁场

5. atma,调谐。 调谐就是调整探头内部的信号接收天线的振荡电路的电容和电阻来实现频率匹配。大家可以把它想象成收音机的调频,也就是如果我们要接收福建广播频道和交通频道,需要调整一样。  


可以通过上面“Acquire”->“Tune”,或者在命令行内输入 atma,然后仪器会自动调谐,会在“数据显示”窗口内出现一下面的窗口。等调谐完成以后,才能进行下一步操作。


      

手动调谐,有时候需要手动调谐,特别是做杂核实验的时候,在命令行内输入 atmm,具体调整操作如下图:


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    • 如果盐浓度太高,会导致调谐失败

    • 对于同一样品,氢通道的调谐只需要做一次,杂核通道的调谐也只需要做一次。比如你做去耦的碳谱,这个时候调谐会同时调整氢通道和碳通道,那么接下来做氢谱就不需要调谐了,做碳氢相关谱图也不需要调谐了。

6. topshim,匀场。通过调节匀场线圈电流来是得检测区域的磁场强度上下左右均匀一致。匀场的好处直接关系到谱图质量,匀场不好,会导致谱峰不对称,分辨率不好甚至分裂。


如果匀场失败,请从底下几个原因查询。虽然有时候匀场成功,但是也会导致谱图质量不好,甚至有裂分现象。这个时候可以重新匀场,或者在命令行输入 topshim tuneaz,也可以输入 topshim tunea;对于水或者粘度比较低的氯仿溶剂,在使用超低温探头的时候,弥补温度梯度的对流,可以使用 topshim convcomp

如果你的样品没有使用氘代试剂,那么上面的匀场方式是不能用的。但是你可以使用19F或者 1H 信号进行匀场。以下以1H信号匀场方案如下:

    1. 先建一个proton的实验,然后在调谐好以后,把实验参数 rg 设置为 1,ns 设置为 1。直接采集 zg。

    2. 采集完以后,变换谱图,寻找最强的谱峰的化学位移位置,加入为 4.7 ppm

    3. 在命令内输入 topshim lockoff 1H o1p=4.7 rga

    4. 等命令执行完成以后,再一次采集前面的氢谱,看看谱峰情况。

    5. 核磁管样品高度是否过低

    6. 样品是否均匀澄清

    7. 样品是否有顺磁性物质

    8. rsh 读取之前匀场参数

    9. 用标准水样品,重新做 topshim 3d

7. getprosol,调取仪器默认参数。


仪器本身根据标准样品调整好激发脉冲的功率和脉宽。但是如果你需要根据你的样品进行90度调整,你可以使用 pulsecal 来调整 1H 的90度脉宽,当然这个命令也可以用来调整杂核的脉宽,但是要主要溶剂信号要足够强。特别是做生物样品,一般使用的是水溶液,具有一定的盐浓度,都需要在做实验前调整90度脉宽。


8. 设置实验参数,ns, sw, o1p 。正常在开始实验前,我们要这是谱图的谱宽,也就是说你需要采集的化学位移要从哪里开始到哪里结束。而核磁设置习惯用 sw 表示谱图总宽度,o1p 表示谱图的中心位置在哪里。你可以在命令行内输入这些指令,在弹出窗口内输入数值。还有一个经常需要调整就是扫描次数,也就是平均累加次数 ns.


9. rga,自动调整增益,避免信号过强导致信号饱和“Overflow”,或者信号比较弱而降低灵敏度。这个你可以理解为数码相机拍照中调整曝光时间一样,如果光线太强就要曝光时间短一点,光线太弱就要时间长一点。

    • 自动调整增益也可以输入 rga,或者可以手动输入增益数值 rg,弹出窗口中输入。

    • 需要注意,不同的增益会影响峰的强度,差不多是线性关系的。比如增益为1和增益为2的强度比为1:2,如果你需要对比的话,请保持增益一样或者考虑这个因素。

10. zg/go,开始采集。请注意直接点击这个按钮,如果该文件夹里面有数据会清空该数据的,所以一定要注意是在你要采集的文件夹上做该操作。


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对于一维谱图,想要在原有谱图基础上继续累加,可以输入 go


开始采集以后,会在 TopSpin 底部出现采集信息,以及剩余时间,如下图所示:

对于1维谱图采集过程中如果需要查看数据,需要用到 tr 等待 Topspin 底部出现“zg:stored NS=…….”信息后,可以进行后数据处理。如果觉得已经得到满意的谱图,输入 halt ,提前停止实验,请勿使用 stop,因为 stop 是停止实验而不保存实验数据。而对于2维谱图,如果在采集过程中需要查看数据,直接输入后输出处理命令就可以了,建议2维谱图不要提前结束实验,会导致间接为分辨率比较差。